Бумажная хроматография

Разновидность хроматографии, которую проводят на бумаге, носит название бумажная хроматография. В основе метода лежит разница в скорости передвижения составных элементов исследуемой смеси по бумаге в потоке элюента. Хроматограмма представляет собой расположение на бумаге хроматографических зон после окончания разделения смеси.

Бумажная хроматография, как метод исследования состава образца материала, был разработан Сингом, Констоном, Мартином и Гордоном еще в 1944 году. Ученые применили этот метод для анализа смеси, в состав которых входили аминокислоты. В следующее десятилетие бумажная хроматография успешно применялась на практике, но впоследствии ее стала вытеснять тонкослойная хроматография, поскольку были установлены ее более высокая эффективность и широта сфер использования. По этим причинам, на сегодняшний день бумажная хроматография редко употребляется для анализа смесей, а ее способы не совершенствуются.

Классификация бумажной хроматографии

Бумажную хроматографию по механизму проведения метода подразделяют на следующие виды:

• адсорбционная – в ее основе лежит различие в адсорбции элементов исследуемого вещества;
• распределительная – основана на разной способности компонентов смеси растворяться в различных растворителях;
• ионообменная – основывается на различных свойствах компонентов к обмену ионами;
• осадочная – в основу положена разная степень растворимости осадков, которые образовываются компонентами исследуемого вещества.

Известны и другие разновидности бумажной хроматографии, но они не получили такого распространения.

Подвижная и неподвижная фазы

Как правило, в качестве неподвижной фазы применяют воду, а в качестве подвижной – органический растворитель либо смесь воды и органических жидкостей. Эти фазы не должны между собой перемешиваться. Подвижная фаза перемещается вдоль бумажного листа под действием капиллярных сил. Подвижность вещества на листе бумаги зависит от коэффициента распределения, а также от содержания вещества в обеих фазах и его взаимодействия с бумажными волокнами.

Носитель

В бумажной хроматографии в качестве носителя для неподвижной фазы применяют целлюлозу, имеющую форму листов бумаги. Даже в сухом виде в ней содержится большой объем связанной воды. Смесь распределяется между растворителем и связанной водой. Для данного вида хроматографии используют бумагу только хорошего качества, которую можно модифицировать для осуществления поставленной задачи. Помимо бумаги из целлюлозы, пользуются бумагой из стекловолокна, так как она обладает устойчивостью к коррозионно-активным веществам и имеет низкую способность к адсорбции.

Среди способов модифицирования бумаги выделяют ацетилирование. Такую бумагу применяют для проведения обогащенно-фазной хроматографии. Было установлено, что модифицированная данным способом бумага подходит для деления рецемических смесей, поскольку ацетилцеллюлоза обладает хиральностью. Такое свойство позволяет энантиомерам двигаться по бумаге с разной скоростью. В качестве носителя неподвижной липофильной фазы также можно использовать и силиконы.

Методика проведения бумажной хроматографии

В данном методе вещества отличаются по положению на бумаге в результате прохождения растворителем определенного расстояния. Определенное количество раствора исследуемой смеси помещают в отмеченную на бумаге точку, затем выполняется высушивание. Образовавшееся пятно называется стартовым. После этого бумагу размещают в герметичной камере, один из ее концов погружают в подвижную фазу (растворитель). Капиллярные силы действуют на растворитель, и он перемещается по бумаге, при этом растворяя и захватывая компоненты смеси. Еще до того, как начнется движение, образец смеси должен быть полностью растворенным. Именно по этой причине скорость растворения элементов смеси в подвижной фазе – это один из ключевых факторов, по которым судят об активности разделения. После прохождения растворителем заданного расстояния, лист бумаги достают и просушивают. Появившиеся пятна (видимые и невидимые) определяют и отмечают.

Показатель Rf означает соотношение расстояния, которое прошло пятно, к расстоянию, которое прошел растворитель. Данная величина имеет зависимость от компонентов смеси, растворителя, бумаги.

Обнаружение пятен

На хроматограммах образовавшиеся пятна можно выявлять посредством химических реакций, а также по флуоресценции, по цвету, по радиоактивности. Как правило, идентификация осуществляется при помощи сравнения пятен с образцами, в которых показатели Rf известны заранее, либо после проведения элюирования. В процессе элюирования вырезают зону с пятном и подвергают ее промыванию определенным растворителем.

Пептидные карты

Идентификация выделяемого белка либо определение состава аминокислот в мутировавшем белке является важной задачей для молекулярной биологии. Именно с этой целью была создана методика «отпечатков пальцев». Если в стандартных условиях белок подвергают расщеплению посредством ферментов, которые разрывают определенные пептидные связи, то в результате образуются пептиды малого размера. Количество и виды получаемых пептидов имеют зависимость от структуры белка и вид примененных ферментов. После этого пептиды разделяют методом двухмерной бумажной хроматографии. В результате получаются пятна, картина распределения которых практически не имеет сходства с разделением других белков. Такого рода пептидные карты получили название «отпечатков пальцев».

Достоинства и недостатки бумажной хроматографии

Несомненно, плюсом данного метода является его высокая чувствительность. С помощью бумажной хроматографии можно обнаружить 10-20 мкг компонента смеси, при этом точность проведенного метода будет составлять 6-7%.

Среди недостатков можно выделить невозможность применения метода для исследования больших объемов смесей, так как в результате чрезмерного количества вещества на хроматограмме его пятна будут расплывчатыми. Слой сорбента под воздействием агрессивных реактивов будет неустойчивым. Если сравнивать бумажную хроматографию с тонкослойной, то в первом случае смесь разделяется медленнее.