Аффинная хроматография

В переводе с латинского языка «аффинный» обозначает «обладающий сродством». В основе аффинной хроматографии лежит принцип избирательной взаимосвязи белков либо иных молекул с лигандами (это специфические вещества, закрепленные на носителе). В качестве лигандов могут использоваться гормоны, коферменты, субстраты, антитела, антигены, рецепторы и прочее./

В качестве достоинства аффинной хроматографии можно отметить тот факт, что она позволяет выделить требуемый белок или еще какой-либо биополимер всего за один этап, при этом выделяемый элемент будет иметь большую степень чистоты. Несмотря на то, что аффинная хроматография является очень тонким и сложным методом, в случае его успешного проведения всегда получается очень эффективный результат.

Суть аффинной хроматографии

В данном виде хроматографии применяются подвижная и неподвижная фазы. Особенностью метода является тот факт, что разделение смеси основывается на специфике функциональных свойств молекулы, а не на ее физико-химических характеристиках. Как правило, разделение смеси происходит в хроматографических колонках в две стадии (адсорбция и десорбция). В некоторых случаях смесь необходимо помещать в емкость с сорбентом и держать до окончательного связывания исследуемого вещества. После этого сорбент требует промывки буферным раствором, что дает возможность удалить не связавшиеся элементы, а затем осуществляется десорбция исследуемого компонента.

Большая специфичность белков по отношению к лиганду, который связан с носителем (им наполняют хроматографическую колонку), объясняется тем, что к лиганду может присоединиться только один белок. С колонки белок снимают посредством элюирования буферными смесями, в которых изменены рН либо ионная сила. Также в состав элюента могут быть введены детергенты, которые делают связь между лигандами и белками слабее.

Аффинную связь элементов смеси сорбента можно нарушить следующими способами:

• посредством создания неблагоприятных условий для специфического взаимодействия;
• прибегнув к конкурентной аффинной элюции.

Существуют следующие виды аффинной хроматографии:

• колоночная жидкостная – через колонку, предварительно наполненную неподвижной фазой, пропускают некоторое количество смеси в потоке элюента (под влиянием силы тяжести либо под давлением);
• тонкослойная жидкостная – в этом случае элюент перемещают по плоскому слою сорбента под воздействием капиллярных сил.

Фазы аффинной хроматографии

Неподвижная фаза представляет собой сорбент, строение которого имеет, как правило, следующий вид: носитель – соединяющее звено (его еще называют ножкой) – специфический лиганд. Наиболее часто в качестве носителя используют сефарозу. Это вещество является производным от агарозы, оно имеет поперечные сшивки. Лиганд или ножка обычно содержат аминогруппу. Их соединение выполняется после того, как сефароза будет активирована бромцианом. Но сефароза имеет слабую устойчивость к влиянию некоторых микроорганизмов и химических веществ.

Подвижная фаза должна элюировать исследуемые смеси c предпочтительными значениями к’. Также она должна иметь малую вязкость, создавать требуемый уровень селективности. Разумеется, подвижная фаза должна быть нетоксичной, должна обладать инертностью, должна иметь низкую стоимость. Обычно в качестве подвижной фазы применяют углеводороды, такие как циклогексан, гептан. К ним добавляют определенное количество CHCI3, изо-С3Н7ОНдиизопропилового эфира. В том случае, если составные части разделяемого вещества имеют приближенные друг к другу значения к’, то хроматографию осуществляют одним элюентом, т.е. применяется изократический режим. Если же сорбент сильно удерживает некоторые компоненты вещества, то прибегают к нескольким элюентам возрастающей силы, т.е. речь идет о непрерывном либо ступенчатом градиентном элюировании.

Требования, предъявляемые к аффинной адсорбции

Неспецифическое взаимодействие должно быть не очень сильным, поскольку важно, чтобы сопутствующие белки не имели возможности соединяться с адсорбентом. Лиганд должен присоединяться к матрице так, чтобы не появлялось затруднительных моментов в процессе привязывания его и белка. Удлиняющий мостик, который располагается между лигандом и матрицей должен образовывать более легкое поступление белка к лиганду. Связь матрицы и лиганда должна быть стабильной на протяжении анализа.